Cambiamenti strutturali ultraveloci dirigono i primi eventi molecolari della visione

Natura volume 615, pagine 939–944 (2023) Citare questo articolo

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La visione viene avviata dalla famiglia della rodopsina di recettori accoppiati a proteine ​​G sensibili alla luce (GPCR)1. Un fotone viene assorbito dal cromoforo retinico 11-cis della rodopsina, che si isomerizza entro 200 femtosecondi nella conformazione all-trans2, avviando così i processi di trasduzione del segnale cellulare che alla fine portano alla visione. Tuttavia, il meccanismo intramolecolare mediante il quale la retina fotoattivata induce gli eventi di attivazione all'interno della rodopsina rimane sperimentalmente poco chiaro. Qui utilizziamo la cristallografia ultraveloce risolta nel tempo a temperatura ambiente3 per determinare come una retina all-trans contorta isomerizzata immagazzina l'energia fotonica necessaria per avviare i cambiamenti conformazionali della proteina associati alla formazione dello stato di segnalazione di legame della proteina G. La retina distorta con un ritardo di 1 ps dopo la fotoattivazione si è staccata dalla metà delle sue numerose interazioni con la sua tasca di legame e l'energia fotonica in eccesso viene rilasciata attraverso un movimento di respirazione proteica anisotropa in direzione dello spazio extracellulare. In particolare, i primissimi movimenti strutturali nelle catene laterali proteiche della rodopsina compaiono in regioni coinvolte nelle fasi successive del meccanismo di attivazione GPCR di classe A conservato. Il nostro studio fa luce sulle prime fasi della visione nei vertebrati e indica aspetti fondamentali dei meccanismi molecolari dell'attivazione del GPCR mediata dall'agonista.

La rodopsina, il recettore dei vertebrati per la visione in condizioni di scarsa illuminazione, è concentrata all'interno delle membrane del disco dei bastoncelli della retina. La rodopsina trasforma l'assorbimento della luce in un segnale fisiologico attraverso cambiamenti conformazionali che attivano la trasducina della proteina G intracellulare, un membro della famiglia Gi/o/t, avviando una cascata di segnali, con conseguente impulsi elettrici inviati al cervello e, infine, portando alla visione. percezione. La struttura della rodopsina è costituita da sette α-eliche transmembrana (TM) con un cromoforo retinale 11-cis legato covalentemente attraverso una base di Schiff protonata (PSB) a Lys2967.43 di TM7 (i valori in apice sugli amminoacidi contenenti la posizione del dominio TM si riferiscono allo schema Ballesteros-Weinstein, spiegato nella sezione "Numerazione dei residui" dei Metodi). Questo ligando sepolto si trova all'interno del fascio TM verso il lato extracellulare, come in molti GPCR di classe A. La retina contatta anche il circuito extracellulare 2 (ECL2), che forma un coperchio sopra il cromoforo e contiene un ponte disolfuro altamente conservato (Cys1103.25–Cys187ECL2) che si collega all'elica centrale TM3 (vedere riquadro 1 del rif. 1). Glu1133.28 fornisce un controione4 carico negativamente che forma un ponte salino con il PSB (Fig. 1a-c) e quindi partecipa alla stabilizzazione dello stato di riposo del recettore5. Dalla nostra comprensione dell'evoluzione dei pigmenti visivi6,7, sappiamo che, originariamente, Glu181ECL2 era l'unico residuo in grado di neutralizzare la carica positiva della base di Schiff. Questo "controione ancestrale"8, che funziona ancora come un controione complesso negli invertebrati6, rimane collegato attraverso una rete di legami idrogeno mediata dall'acqua al PSB delle rodopsine dei vertebrati (Fig. 1b). Il secondo controione principale Glu1133.28 è apparso durante l'evoluzione ed entrambi i residui sono importanti per il meccanismo di attivazione. Strutture di rodopsina attivata dalla luce intrappolata a bassa temperatura9,10, strutture dello stato attivo della tarda Meta II11,12,13 e numerosi studi computazionali14, biochimici e spettroscopici15,16,17 hanno fornito importanti informazioni sul meccanismo di trasduzione del segnale nella rodopsina . Tuttavia, sono necessari metodi che forniscano un'elevata risoluzione spaziale e temporale per ottenere un quadro completo derivato sperimentalmente del meccanismo di attivazione su scala atomica da femtosecondi a millisecondi.

a, La struttura complessiva della rodopsina, arcobaleno colorato in base al numero di residui dal blu (terminale N) al rosso (terminale C). Il fascio di sette TM contiene due domini di N-glicosilazione (GLYC) e gruppi palmitato (PLM) che ancorano l'elica anfipatica H8 alla membrana (linee grigie). Le molecole d'acqua (sfere rosse) formano reti chiave1 tra le regioni extracellulari (tasca di legame del ligando retinico) e intracellulari (sito di legame della proteina G) del recettore. La retina 11-cis (rosso scuro) è legata covalentemente a Lys296 (riquadro) attraverso il PSB. La tasca di legame retinale è ulteriormente composta da amminoacidi che circondano il PSB (il controione Glu113 e Met44, Phe91, Thr94, Ala292 e Phe293), la catena alifatica retinica (Ala117, Thr118, Tyr191, Trp265 e Glu181/Ser186 attraverso l'acqua W01 ) e l'anello β-ionone (Gly120, Gly121, Glu122, Phe212, Met207, Phe261 e Ala269; per chiarezza, sono mostrati solo i residui selezionati nella tasca di legame). b, c, Esempi di molecole ben risolte nelle reti mediate dall'acqua che collegano i residui nella rete ancestrale del controione Glu181 (b) e il controione da Glu113 a Met86 di TM2 (e Ala1173.32, non mostrato) (c). Le molecole d'acqua hanno densità elettroniche ben definite (reti grigie e blu, densità elettronica 2Fobs - Fcalc contornate rispettivamente a 2,2 e 0,7σ).