Crio

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 9930 (2022) Citare questo articolo

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La microscopia elettronica criogenica è diventata un potente strumento per studiare oggetti biologici. Per gli oggetti non biologici (soluzioni, gel, dispersioni, argille), la polemica sull'interpretazione dei risultati della microscopia criogenica è ancora in corso dividendosi su due tendenze contraddittorie: considerare la struttura come uno stato quasi reale del campione o come artefatti da congelamento. In questo studio, è stata studiata la microstruttura di una gamma di soluzioni e dispersioni acquose stabili (agar, caolino, montmorillonite, nanoparticelle) mediante crio-SEM e LSM confocale al fine di confrontare strutture criofissate e non congelate. La correlazione osservata tra questi due metodi per i sistemi studiati (agar, caolino, montmorillonite, NP) ha permesso di affermare che la microstruttura ordinata è una caratteristica intrinseca di questi sistemi. Alcune incoerenze nelle dimensioni della microstruttura sono state discusse e prescritte alle differenze negli strati di massa e di interfaccia. Presumibilmente, le soluzioni di NaCl possiedono anche una microstruttura dinamica (a livello di femtosecondi) di cluster di acqua pura e ioni Na+ e Cl- solvatati che possono avere un impatto sulle proprietà anomale degli elettroliti.

Dalla scoperta della microscopia elettronica criogenica (crio-EM) più di trent'anni fa, sono stati accumulati molti dati in questo campo1,2. Questa tecnica di imaging consente di osservare campioni su scala micro e nanometrica nel loro ambiente acquoso nativo, senza essiccazione che causa una deformazione irreversibile della struttura. L'osservazione diventa possibile grazie alla solidificazione dell'acqua da parte di agenti criogenici, cioè alla criofissazione. Quest'ultimo è un passaggio fondamentale in questa tecnica: il congelamento ultraveloce impedisce la crescita dei cristalli di ghiaccio mantenendo intatte le strutture originali. La criofissazione si ottiene solitamente immergendo un campione in un crioagente (granita di azoto, propano, etano, ecc.), seguita dalla fratturazione (per osservare la struttura interna del campione) e dalla sublimazione (cioè, incisione su ghiaccio) che consente di osservare la struttura senza strato d'acqua. Oggi, la tecnica cryo-EM è diventata un potente strumento per studiare oggetti biologici. Una discussione di lunga durata sulla congruenza tra la loro microstruttura negli stati criofissati e non congelati è stata completata dal consenso sul fatto che i risultati della crio-EM riflettono lo stato quasi reale dei campioni biologici in parte dei loro elementi strutturali più densi (scheletro, membrana, ecc.). )1,2. Il consenso si basava sui dati accumulati che mostravano la correlazione tra le diverse tecniche di imaging. Per quanto riguarda le componenti biologiche liquide e gelatinose (muco, liquidi inter ed extracellulari, ecc.), permangono i dubbi che potrebbero essere imputati alle difficoltà di visualizzazione di strutture a bassa densità (basso contrasto, mobilità, ecc.) . Uno dei modi per risolvere questo problema è sviluppare tecniche che permettano di osservare campioni bagnati in condizioni prossime a quelle native ad alta risoluzione. In questa direzione, è stato segnalato lo sviluppo di un nuovo SEM atmosferico (ASEM), che è una combinazione di un microscopio elettronico a scansione invertita (con una piastra di coltura aperta staccabile) e un microscopio a fluorescenza. L'ASEM consente di osservare quasi simultaneamente la stessa area dalla parte superiore e inferiore del campione in soluzione acquosa (incapsulata in una pellicola SiN permeabile agli elettroni) a pressione atmosferica. Utilizzando questa tecnica, sono state acquisite immagini delle connessioni neuronali, degli osteoblasti, del reticolo endoplasmatico, dei tessuti ossei, dell'endocitosi cellulare e della mitosi3,4.

Rispetto agli oggetti biologici, i sistemi acquosi non biologici (ad esempio soluzioni, dispersioni, gel, argille) non possiedono confini di fase distinti (densi) nell'acqua e l'interpretazione dei loro risultati crio-EM è ancora ambigua e divisa in due tendenze contraddittorie. Secondo una tendenza, la microstruttura osservata nei campioni criofissati viene interpretata come il risultato della formazione di cristalliti acquosi, come un artefatto da congelamento5,6,7,8,9,10,11. Quest'ultimo appare quando le sostanze disciolte/disperse diffondono verso la periferia del cristallo di ghiaccio portando alla formazione della struttura7. All'interno di un'altra tendenza, la microstruttura dei campioni criofissati è considerata allo stato quasi reale. Questo punto di vista è spesso supportato dalla correlazione con immagini al microscopio ottico o confocale a scansione laser (LSM), come è stato mostrato, ad esempio, per fluidi di fratturazione schiumosi, emulsioni formate con pectina di mela, dispersioni di nanoparticelle, argille minerali8,11,12, 13,14,15. Le differenze notate nella dimensione della microstruttura (se si confrontano i risultati LSM e crio-EM) non sono state interpretate e, quindi, creano confusione8. Le opinioni contraddittorie sulla microstruttura criofissata indicano un'incoerenza dei risultati sperimentali con il concetto generalmente accettato di soluzioni e colloidi come molecole/ioni/particelle distribuiti omogeneamente nel solvente16. Pertanto, la polemica sull’interpretazione delle osservazioni al microscopio criogenico di campioni non biologici è ancora in corso e sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire questo problema.