Un dentro

Nature Communications volume 14, numero articolo: 1545 (2023) Citare questo articolo

1750 accessi

21 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

La principale proteasi della SARS-CoV-2 (Mpro) è responsabile della scissione della poliproteina virale. L'autoelaborazione Mpro è chiamata maturazione ed è fondamentale per la dimerizzazione e l'attività degli enzimi. Qui utilizziamo C145S Mpro per studiare la struttura e la dinamica della scissione N-terminale in soluzione. L'analisi della spettroscopia di massa nativa mostra che gli stati oligomerici misti sono composti da particelle scisse e non scisse, indicando che l'elaborazione N-terminale non è critica per la dimerizzazione. Una struttura crio-EM da 3,5 Å fornisce dettagli della scissione N-terminale Mpro al di fuori dei vincoli dell'ambiente cristallino. Mostriamo che diverse classi di inibitori spostano l'equilibrio tra gli stati oligomerici. Mentre l'inibitore non covalente MAT-POS-e194df51-1 previene la dimerizzazione, l'inibitore covalente nirmatrelvir induce la conversione dei monomeri in dimeri, anche con N-termini intatti. I nostri dati indicano che la dimerizzazione di Mpro è innescata dall'adattamento indotto dovuto al collegamento covalente durante l'elaborazione del substrato piuttosto che dall'elaborazione N-terminale.

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è l’agente eziologico del COVID-191. Come il SARS-CoV e il coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV), il SARS-CoV-2 è un virus RNA a filamento singolo (ssRNA) che appartiene ai generi dei beta-coronavirus1,2. Il genoma della SARS-CoV-2 è composto da quasi 30.000 nucleotidi che contengono il gene ORF1ab, un grande open-reading-frame (ORF) responsabile della codifica di 16 proteine ​​non strutturali (nsp) come due poliproteine ​​dopo il frameshifting ribosomiale, denominate 1a e 1b1,2,3. L'elaborazione proteolitica delle poliproteine ​​virali è essenziale per il ciclo di vita virale ed è eseguita da due proteasi della cisteina codificate da SARS-CoV-2: la proteasi simile alla papaina (PLpro), che è uno dei domini di nsp3, e la proteasi principale virale (Mpro o 3CLpro), codificato dal nsp54,5. PLpro scinde la poliproteina virale in tre siti, mentre Mpro è responsabile della scissione della poliproteina in undici siti distinti4,5, inclusi i propri terminali N e C6. Mpro è uno degli obiettivi più promettenti per lo sviluppo di farmaci contro SARS-CoV-25,7. Tutte le informazioni strutturali e biochimiche raccolte su questo bersaglio sono state cruciali per il rapido sviluppo di nuovi antivirali8,9,10,11, incluso il recente farmaco Paxlovid/nirmatrelvir10, approvato per l'uso di emergenza negli Stati Uniti, in Europa e in Cina.

Per ottenere Mpro maturo espresso eterologo, i ricercatori hanno adottato la strategia generale di aggiungere la porzione C-terminale di nsp4 alla porzione N-terminale dei costrutti nsp5, consentendo l'autoscissione e la dimerizzazione di Mpro in vitro6. In precedenza, abbiamo descritto l’attività e il profilo biochimico del mutante SARS-CoV-2 Mpro C145S contenente la porzione C-terminale di nsp4 al suo N-termini6. Questa mutazione della serina ha generato una versione attiva ma molto più lenta di Mpro, uno strumento prezioso per studiare gli aspetti biochimici di questo enzima. Diversamente dal dimerico Mpro, questo campione si è comportato come un mix dinamico di monomeri, dimeri, trimeri e tetrameri in soluzione6. L'attività residua di questo mutante della serina ha consentito la lenta scissione del peptide N-termini nsp4-nsp5, che ci ha permesso di monitorare gli stati oligomerici di Mpro in soluzione durante il processo di maturazione6. Abbiamo osservato che la forma tetramerica di Mpro C145S raggiunge l'equilibrio come dimeri nel corso di due giorni, in un fenomeno che è direttamente proporzionale alla scissione N-terminale, deducendo quindi che il trattamento N-terminale era fondamentale per la dimerizzazione6. Inoltre, abbiamo precedentemente rivelato la struttura cristallina di Mpro C145S in complesso con il peptide C-terminale nsp5-nsp6, ottenuto dal campione tetramerico Mpro, presentando una rappresentazione dettagliata di questo evento chiave di maturazione della scissione. In sintesi, due dimeri Mpro maturi si assemblano in un complesso transitorio dimero-dimero, posizionando il terminale C di una molecola Mpro verso il sito attivo di un'altra e seguito dall'elaborazione C-terminale in un evento di trans-scissione6.