Vetrificazione automatizzata della crioterapia

Nature Communications volume 13, numero articolo: 2985 (2022) Citare questo articolo

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La velocità e l’efficienza della raccolta dei dati e dell’elaborazione delle immagini nella microscopia crioelettronica sono aumentate negli ultimi dieci anni. Tuttavia, le tecniche di preparazione dei campioni criogenici sono in ritardo e sono necessari dispositivi di preparazione dei campioni più veloci e riproducibili. Qui presentiamo un dispositivo di vetrificazione con gestione dei campioni altamente automatizzata, che richiede solo un'interazione limitata da parte dell'utente. Inoltre, il dispositivo consente l'ispezione di film sottili mediante microscopia ottica, poiché il liquido in eccesso viene rimosso tramite aspirazione tramite tubi e non con carta assorbente. In combinazione con il controllo del punto di rugiada, ciò consente la preparazione del film sottile in modo controllato e riproducibile. Il vantaggio è che la qualità del campione criogenico preparato viene caratterizzata prima dell'acquisizione dei dati al microscopio elettronico. La praticità e le prestazioni del dispositivo sono illustrate con risultati sperimentali ottenuti mediante vetrificazione di sospensioni proteiche, vescicole lipidiche, cellule batteriche e umane, seguiti da immagini mediante analisi di singole particelle, tomografia crioelettronica e microscopia ottica ed elettronica criocorrelata.

La criofissazione nell'acqua vitrea (ghiaccio amorfo) mediante congelamento rapido di campioni biologici può garantire una conservazione strutturale quasi perfetta di campioni biologici come sospensioni proteiche, virus, batteri e cellule eucariotiche. La criofissazione richiede una velocità di congelamento sufficientemente elevata (>100.000 °C/s) da impedire la formazione di ghiaccio (cristalli). Di conseguenza, l’acqua adotta uno stato transitorio amorfo e metastabile simile al vetro1. Utilizzando la vetrificazione, la struttura delle proteine ​​e delle cellule può essere preservata nel loro ambiente idratato nativo fino alla risoluzione atomica. I campioni vetrificati sono compatibili con le condizioni di vuoto richieste per la microscopia crioelettronica (cryo-EM) e possono anche essere studiati con la microscopia ottica a criofluorescenza (cryofLM)2. La microscopia correlativa a luce ed elettronica (CLEM)3 unisce i vantaggi dell'EM (alta risoluzione, contesto strutturale) con i vantaggi dell'ampia gamma di tecniche di microscopia ottica disponibili (imaging dal vivo, etichettatura versatile)4,5.

La vetrificazione mediante congelamento a immersione utilizzando etano liquido o una miscela di etano/propano come agente criogenico6 si è rivelata un approccio pratico per la criopreparazione di campioni biologici con spessore fino a 10 micron1,7. Per la crio-EM, le sospensioni purificate di proteine ​​e virus vengono conservate in sottili strati di acqua che misurano diverse decine di nanometri, da cui è possibile determinare le ricostruzioni della risoluzione atomica utilizzando SPA8,9. Anche strutture più grandi, come batteri e cellule aderenti fino a pochi micron di spessore, sono adatte alla vetrificazione. Le ricostruzioni tridimensionali con risoluzione molecolare possono essere determinate utilizzando la tomografia crioelettronica (cryo-ET) di campioni fino a circa mezzo micron di spessore10,11. Ridurre al minimo lo spessore dello strato liquido è importante poiché il mezzo che circonda il campione disperde gli elettroni, aggiungendo rumore di fondo nelle immagini, abbassando così il rapporto segnale-rumore nelle immagini e riducendo la risoluzione ottenibile nelle risultanti ricostruzioni tridimensionali.

Il passaggio essenziale di generare un sottile strato di campione liquido su un supporto per campione di microscopia elettronica per EM (tipicamente uno strato di carbonio bucato supportato da una griglia di rame di 3,05 mm di diametro) è problematico, poiché gli strati sottili di acqua sono intrinsecamente instabili e devono avere un controllo esatto sulla lo spessore dello strato d'acqua è difficile. Si è scoperto che rendere idrofila la pellicola di supporto mediante scarica a bagliore in aria o alchilammina12,13 aiuta a formare un sottile strato liquido sulla pellicola di supporto e un ambiente saturo di umidità aiuta a stabilizzare lo strato sottile. La pratica comune attuale consiste nell'applicare diversi microlitri di soluzione del campione su una pellicola di supporto scaricata a bagliore, seguita dall'eliminazione del fluido in eccesso utilizzando carta da filtro che viene successivamente congelata a immersione14,15.